Гипотеза восстановительной горячей точки в старении

В прежних моделях порочного круга не требовалось изобретать никакого дополнительного механизма, чтобы объяснить, какой вклад дают мутации митохондриальной ДНК в старение, поскольку предполагалось накопление с возрастом все более дефектных митохондрий во множестве клеток.

По мере того, как в этих клетках все больше и больше митохондрий случайным образом подвергаются свободнорадикальной бомбардировке, сами клетки все больше и больше страдают от окислительных повреждений, все больше и больше испытывают дефицит аденозинтрифосфата и эффективность производства энергии с каждым новым дефектом падает.

Это было красивое разумное объяснение роли мутантных митохондрий в старении организма.

Но, как мы видели, оно явно неправильное. В большинстве клеток организма с возрастом не накапливаются мутантные митохондрии; это происходит самое большее в 1% из многих миллиардов составляющих организм клеток. Большинство клеток и тканей не страдают от падения производства или доступности аденозинтрифосфата (АТР), а образование свободных радикалов вовсе не возрастает, в большинстве накапливающихся мутантных митохондрий вообще не образуются свободные радикалы, поскольку отсутствует место их образования - цепь переноса электронов.

Трудно было понять, каким образом столь малое число клеток, содержащих мутантные митохондрии и не причиняющих никакого явного вреда окружающим клеткам, могут быть движущей силой старения организма. Под грузом фактического материала многие биогеронтологи решили похоронить эту теорию старения. Однако нельзя сбросить со счета косвенные указания на вклад мутаций митохондриальной ДНК в старение. Чтобы согласовать две группы данных, требовалось истинно новое решение загадки.

Любой усовершенствованный вариант теории старения на основе свободнорадикального поражения митохондрий должен включать два момента. Во-первых, поскольку клеток, захваченных негодными энергостанциями, мало, нужен какой-то механизм распространения вреда из клеток с мутантными митохондриями за их пределы. Во-вторых, нужно объяснить природу этого вреда, поскольку обычное предположение (свободные радикалы), по-видимому, исключалось тем фактом, что в мутантных митохондриях нормальное образование свободных радикалов перекрыто в самом их источнике.

Что в первую очередь нужно для выживания клеток, занятых мутантными митохондриями? Что им служит источником энергии? Мутантные митохондрии не только не способны осуществлять окислительное фосфорилирование, которое должно удовлетворять в основном потребность клетки в аденозинтрифосфате, но непонятно, как они вообще могут производить энергию в какой бы то ни было форме.
В верх по течению от перекрытой плотины
В нормальных клетках первый этап метаболизма глюкозы, поступившей с пищей, происходит в цитоплазме в процессе так называемого гликолиза, представляющего собой цепь химических реакций, в результате которых образуется АТР, пируват (продукт расщепления глюкозы) и некоторое количество электронов, которые могут привести в действие механизм окислительного фосфорилирования в митохондриях. Для переноса этих электронов в митохондрии служат специальные молекулы-переносчики, в частности никотинамидадениндинуклеотид (NAD+). Его восстановленная форма обозначается NADH.

Продукт гликолиза - пируват - тоже поступает внутрь митохондрий, где он далее расщепляется с образованием промежуточного продукта, называемого ацетилкоэнзимом А (сокращенно ацетилСоА). Этот последний затем используется как сырье в сложной последовательности химических реакций, называемой циклом трикарбоновых кислот (или циклом Кребса, или циклом лимонной кислоты), в результате которой получается намного больше электронов (также используемых для образования NADH), чем путем гликолиза.

Наконец, NADH, получивший электроны в результате всех этих процессов (гликолиза, образования ацетилСоА из пирувата и цикла трикарбоновых кислот), поступает в цепь переноса электронов, где электроны используются для создания "резервуара" протонов, приводящих в действие механизм генерации энергии, дающий почти все требуемое клетке ее количество.

Биохимия этих процессов хорошо изучена, ее и студенты должны знать. Все они предназначены для поставки электронов в митохондриальную цепь их переноса. Что же будет, если эта цепь не действует, как в клетках с мутантными митохондриями?

На каждом этапе от гликолиза до цикла трикарбоновых кислот включительно электроны "отгружаются" на никотинамидадениндинуклеотид для отправки в цепь переноса электронов. Количество этих молекул-переносчиков, доступных для восстановления до NADH, ограничено, но в норме это несущественно: их всегда достаточно, потому что, отдав свой электрон в митохондриальную цепь переноса электронов, NADH превращается обратно в NAD+.

Но, когда естественный "прием груза" (электронов) отсутствует, NADH, по-видимому, некуда девать. (Сходную картину можно себе представить, вообразив, что все нефтеперегонные заводы на Земле вдруг встали. Тогда добычу нефти придется повсеместно прекратить, иначе нефтеналивные суда некуда будет разгружать, и, раз нагруженные, они так и останутся со своей опасной ношей и будут копиться, громоздясь, как в кошмаре.) Поскольку на каждом этапе - для гликолиза, для образования ацетилСоА из пирувата, для цикла трикарбоновых кислот - нужен никотинамидадениндинуклеотид, отсутствие последнего должно, на первый взгляд, привести к остановке всего энергопроизводящего конвейера и у клетки вообще не останется механизмов генерации энергии в виде аденозинтрифосфата, даже в относительно небольших количествах, которые обеспечивались перечисленными этапами.

Ситуация в клетках с мутантными митохондриями может быть еще хуже. NAD+ требуется для различных клеточных функций, помимо производства энергии. В отсутствие нормального кругооборота никотинамидадениндинуклеотид/NADH осуществление этих функций будет истощать запас NAD+ и пополнять запас NADH, еще более расшатывая равновесие в клетке. По мнению некоторых исследователей, многие из осложнений диабета обусловлены избытком NADH и нехваткой никотинамидадениндинуклеотида, ведущих к нарушениям ряда процессов обмена веществ (хотя дисбаланс NAD+/NADH при диабете имеет иные причины, отличные от потери способности к окислительному фосфорилированию).

Но, несмотря на все это, клетки, содержащие мутантные митохондрии, выживают, что демонстрируется их накоплением с возрастом. Значит, они где-то берут АТР. Большинство специалистов полагали, что в клетках с мутантными митохондриями прекращается цикл трикарбоновых кислот, а энергию дает гликолиз. Так бывает в мышечных клетках в порядке временной меры при большой анаэробной нагрузке, т.е. когда клетка работает столь интенсивно, что истрачивается весь имеющийся кислород, так что невозможно продолжать окислительное фосфорилирование. Тогда гликолиз обеспечивает клетку небольшим, но достаточным количеством аденозинтрифосфата. По этой логике клетка будет справляться с небольшим избытком NADH благодаря превращению пирувата в молочную кислоту (в этом состоит биохимическая природа хорошо известной спортсменам жгучей боли в мышцах на излете резкого их напряжения, например, у штангиста на последнем подходе к снаряду).

Эта теория не согласуется с фактами. Начать с того, что не наблюдается ожидаемого всплеска уровня молочной кислоты. Еще непонятнее, что в клетках с мутантными митохондриями вместо падения активностей ферментов, участвующих в цикле трикарбоновых кислот, (чего можно было бы ожидать из-за отсутствия свободного никотинамидадениндинуклеотида) имеет место их гиперактивность. Как же поддерживается невозможный, казалось бы, процесс?
Урок мистера Никто
Прорыв к пониманию этого явления произошел, когда были созданы так называемые р0 (ро-ноль) клетки, у которых в митохондриях вообще нет ДНК. Функционально они подобны клеткам с мутантными митохондриями, в которых из-за делеций отсутствует способность к трансляции генетической информации с образованием функциональных белков. Нетранслируемая ДНК все равно, что отсутствует: невозможно пользоваться инструкцией, которую нельзя прочитать. Делеции в митохондриальной ДНК ставят митохондрии в такое же положение, как полное отсутствие ДНК.

Одним из первых свойств р0 клеток обнаружилась их малая продолжительность жизни: эти клетки очень быстро гибли, если только культуральная среда не содержала определенных компонентов, которых в норме нет в межклеточной жидкости организма. Парадоксально, некоторъе из этих веществ не обладали способностью проникать внутрь клеток. Отсюда следовало, что каков бы ни был механизм их действия, он осуществляется снаружи клетки. У меня будто свет забрезжил в голове; ведь я искал способ объяснить, каким образом клетки, занятые мутантными митохондриями, распространяют вред за свои пределы, влияя на весь организм. Что если эти вещества спасают 0-клетки потому, что снимают с них груз какой-то вредоносной субстанции?

А что если этой вредоносной субстанцией являются как раз... электроны?

Связаны ожидаемый избыток NADH в клетках, не способных осуществлять окислительное фосфорилирование, и зависимость р0-клеток от присутствия обезвреживающих веществ в окружающей среде. Клеткам с мутантными митохондриями нужно куда-то девать электроны, чтобы появился свободный NAD+, а обезвреживающие вещества все оказались акцепторами электронов и могли действовать даже снаружи клетки. И вот моя гипотеза: клетки с мутантными митохондриями избегают губительного накопления неиспользованных электронов, выделяя их наружу посредством примерно такого же механизма, какой обеспечивает выживание р0-клеток в культуре, и таким образом вредоносные агенты (электроны) распространяются по организму.
Предохранительный клапан
Чтобы превратить эту идею в новую формулировку теории старения на основе митохондриальных свободных радикалов, нужно четко ответить на три вопроса. Первый: каким образом образующиеся внутри клетки электроны передаются на акцепторы, находящиеся по другую сторону клеточной мембраны? Второй: раз акцепторы электронов, использовавшиеся в экспериментах с р0-клетками, не содержатся в жидкостях тела (или присутствуют там в неадекватных концентрациях), то что играет роль акцепторов электронов для клеток с мутантными митохондриями в организме? Третий: есть ли объяснение распространению вреда от клеток с мутантными митохондриями по всему организму, что, по-видимому, должно иметь место, если они играют значительную роль в старении?

На первый вопрос ответ, оказывается, уже имеется. Давно известно о существовании в клеточной мембране механизма экспорта электронов, который сейчас называют окислительно-восстановительной системой плазматической мембраны (PMRS - от англ. Plasma Membrane RedOx System). Его истинное назначение в организме было малопонятным, но основная функция установлена: он принимает электроны изнутри клетки от NADH и транспортирует их наружу, тем самым, осуществляя кругооборот NADH/никотинамидадениндинуклеотид. Этот механизм позволяет и нормальным клеткам лучше регулировать внутриклеточное равновесие между окислителями и восстановителями и поддерживать наличие NADH и NAD+, требующихся для жизненно важных биохимических реакций.

Иными словами, этот механизм делает как раз то, что нужно для выживания клеток с мутантными митохондриями. PMRS оказался почти безупречным кандидатом на эту роль. Изучавший его д-р Альфонс Лауэн из Университета Монаш (Австралия) к тому времени уже показал (и не подозревая о применении в теориях старения, заметьте) не только что механизм PMRS способен подавать электроны на те самые не проникающие через клеточную мембрану акцепторы электронов, которые способствуют выживанию р0-клеток, но и что активность PMRS необходима для их выживания. Это доказывало, что экспорт электронов - необходимое условие выживания клеток и что PMRS служит для их выхода из клетки в окружающую среду, как из гавани в открытое море.

Способность клеток с мутантными митохондриями превращать NADH обратно в никотинамидадениндинуклеотид позволяет им осуществлять процесс нормальной клеточной жизнедеятельности, не перегружаясь электронами до такой степени, при которой внутриклеточная среда становится совершенно неподходящей для других важных химических реакций. Более того, это дает разумное объяснение тому факту, что в клетках с мутантными митохондриями активен цикл трикарбоновых кислот.

В отсутствие окислительного фосфорилирования усиленное функционирование цикла трикарбоновых кислот вдвое увеличивает производство необходимого АТР за счет сахаров (а также позволяет решить много других метаболических задач, в которых участвует цикл трикарбоновых кислот). Это становится возможным благодаря PMRS, который включает значительно возросшее количество NADH в кругооборот, обеспечивая клетку дополнительным количеством NAD+, требующимся для цикла трикарбоновых кислот.

Но из-за значительного увеличения активности PMRS, нужного, чтобы поддерживать возросшую активность цикла трикарбоновых кислот, поверхность клеток с мутантными митохондриями так и кишит экспортированными электронами, так что создается "горячая точка" восстановительного потенциала (т.е. нестабильный избыток электронов). Естественно, возникает следующий вопрос - на какие молекулы PMRS разгружает излишек электронов?

Из тех акцепторов электронов, которые использовались для сохранения жизнеспособности р0-клеток в культуре, ни один не содержался в живом организме в достаточной концентрации -значит, что-то еще выполняло эту ключевую роль. Например, какую-то часть электронов мог бы принимать дегидроаскорбат - продукт превращений витамина С, образующийся после того, как тот используется для нейтрализации свободных радикалов; однако его недостаточно, чтобы справиться с мощной восстановительной "горячей точкой", создаваемой клетками с мутантными митохондриями.

С ролью акцептора электронов отлично справится двуликий кислород.

Разумеется, кислород способен принимать электроны из своего окружения. Именно так в митохондриях образуются свободные радикалы в ходе окислительного фосфорилирования: "ушедшие в аут" электроны с электрон-транспортной цепи подбираются молекулами кислорода, растворенного в окружающей клетки среде. И кислород - единственный компонент жидкостей организма, способный акцептировать электроны и присутствующий в количестве, достаточном для поглощения той колоссальной утечки электронов, какая должна быть в клетках с мутантными митохондриями.

В идеале связывание электронов кислородом может быть безопасным: механизм PMRS будет нагружать по четыре электрона на каждую молекулу кислорода, превращая его в воду, как это происходит с электронами, нормально следующими по цепи переноса электронов. Но в высшей степени вероятно, что на PMRS какое-то количество электронов тоже "уходит в аут"; их, может быть, довольно много. В таком случае на поверхности клеток с мутантными митохондриями будет образовываться много супероксидных радикалов, последствия чего, очевидно, вредны.

Но на деле, может быть, и не очень вредны. Можно ожидать, что негативный эффект ограничится ближайшим окружением. Как почти все свободные радикалы, супероксид химически очень активен, а потому живёт очень коротко. Справятся ли с ним местные антиоксиданты или он атакует первое, с чем столкнется (мембрану соседней клетки, например) - его агрессивность тем самым будет погашена. Супероксид наверняка не остается свободным радикалом достаточно долго, чтобы достигнуть удаленных участков тела, как это предполагает теория митохондриальных свободных радикалов.

Но что если образованный PMRS супероксид поразит не компоненты ближайших клеток, а какие-то другие молекулы, которые достаточно стабильны, чтобы путешествовать по организму? На такую роль напрашивается содержащийся в сыворотке крови холестерин, особенно в форме частиц LDL (липопротеидов низкой плотности - тех, что называют "плохим" холестерином), в составе которых холестерин доставляется к клеткам по всему организму.

Известно, что окисленный (или, иначе, модифицированный) холестерин действительно имеется в организме, и общепризнано, что он главный виновник развития атеросклероза. Представлялось вероятным, что появляющийся на поверхности клеток с мутантными митохондриями супероксид может окислять проплывающие мимо частицы LDL, которые оказываются легкой добычей не только потому, что их везде много, но и потому, что из-за наличия в них слабо связанных реакционноспособных ионов металлов, например железа, взаимодействие с супероксидом еще более вероятно. Можно было бы полагать, что присутствие антиоксидантов, например растворенного в LDL витамина Е, предотвратит атаку супероксида, но установлено, что это не так.

Окисленные LDL обычны в организме, и с помощью надежных методов анализа, выявляющих перекисное окисление липидов, показано, что добавки витамина Е не уменьшают окисление жиров у здоровых людей. Фактически, отсутствие антиоксидантных компонентов в недоступной "сердцевине" частицы LDL означает, что когда она подвергается воздействию более интенсивному, чем обычная свободнорадикальная атака, присутствующий в ней витамин Е на самом деле ускоряет распространение свободных радикалов в глубь частицы в процессе так называемого токоферол-опосредованного перекисного окисления (токоферол - одно из названий витамина Е).

Окисление LDL  -весьма правдоподобный механизм, объясняющий способность клеток с мутантными митохондриями распространять оксидативный стресс по всему стареющему организму. Холестерин в составе LDL, хотя и способствует развитию атеросклероза (когда содержится в крови в избытке), выполняет в организме важную функцию. Холестерин нужен клеткам для формирования мембран, и LDL служат для доставки холестерина из печени и кишечника (где он производится или извлекается из пищи) туда, где он требуется клеткам.

Но если несомый LDL холестерин окисляется, встречая по пути клетки с мутантными митохондриями, то частицы LDL превращаются в опасного троянского коня, доставляя клеткам вредоносный груз - испорченный холестерин. В поглотивших его клетках свободнорадикальное поражение продолжится в хорошо известном комплексе химических реакций, ведущих к прогорканию жиров. С течением времени все больше и больше клеток будут заняты мутантными митхондриями, все больше и больше клеток поглотят окисленные LDL, и оксидативный стресс постепенно захватит весь организм.
Новая теория старения из-за митохондриальных свободных радикалов
Теперь выяснилась полная подробная непротиворечивая картина, объясняющая связь между митохондриальными свободными радикалами и усилением оксидативного стресса во всем организме с возрастом. Эта гипотеза отвечает на все поставленные ключевые вопросы и разрешает все явные парадоксы, из-за которых очень многие ученые вообще отказались от теории старения на основе митохондриальных свободных радикалов.

Свободные радикалы вызывают делеции митохондриальной ДНК. Мутантные митохондрии не способны осуществлять окислительное фосфорилирование, из-за чего резко ослабевают как производство аденозинтрифосфата, так и образование свободных радикалов. Поскольку мембраны мутантных митохондрий особо не подвергаются свободнорадикальной атаке, лизосомный аппарат клетки не распознает в них дефектные органеллы, подлежащие уничтожению, и мутантные митохондрии постепенно вытесняют нормальные (неадаптивный эволюционный процесс, названный мною SOS - выживанием худших.)

Чтобы продолжать производство АТР и других соединений, нужных для выживания клетки, в мутантных митохондриях поддерживается активность цикла трикарбоновых кислот, которая вместе с другими продолжающимися процессами клеточной жизнедеятельности быстро истощает запас необходимого во всех этих процессах никотинамидадениндинуклеотида, если он не освобождается от "груза" электронов. Последнее осуществляется посредством "предохранительного клапана" для избытка электронов на клеточной мембране - PMRS (окислительно-восстановительной системы плазматической мембраны).

Избыток электронов, скопляющихся на внешней поверхности клетки, превращает ее в восстановительную "горячую точку", создающую устойчивый поток супероксидных свободных радикалов. Они портят проходящие мимо частицы LDL, которые затем доносят вред до других, удаленных от "горячей точки" клеток, приводя к системному усилению оксидативного стресса во всем организме с возрастом. Из-за оксидативного стресса повреждаются белки, липиды и ДНК, начинаются воспалительные процессы, нарушения клеточного метаболизма и генной экспрессии. Такие события определенно могут продвигать биологическое старение.

Как вы, вероятно, отметили эта теория в целом непривлекательна своей сложностью. Но она единственная объединяющая все данные. В конце 1990-х годов одна за другой были опубликованы две статьи на эту тему, а более подробное единое ее изложение приняли как тезисы диссертации на соискание степени доктора философии в Кембриджском университете и напечатали в серии "Molecular Biology Intelligence Unit" (Lances Bioscience). В последующие годы эта теория широко обсуждалась и цитировалась в научной литературе. Увы, несмотря на это как в популярной прессе, так и среди биогеронтологов продолжается использование давно отвергнутых теорий порочного круга для поддержки или развенчания роли митохондрий в старении вместо того, чтобы всерьез взять на вооружение детальное описание наиболее вероятного механизма старения.

Итак, теперь вы познакомились в деталях с пониманием вероятной важной роли мутаций митохондриальной ДНК в старении у млекопитающих и узнали, почему включены они в категорию "нарушения/повреждения" концепции SENS.

Ди Грей Обри

medbe.ru