Митохондриопатии в процессе старения

Среди препятствий на пути клинической разработки медико-биологических методов борьбы со старением имеется и формальное: старение не является идентифицированной признанной болезнью, нозологической единицей, поэтому Управление по контролю качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (известное под сокращением FDA) не даст разрешения на испытание вмешательства, заявленного как средство для борьбы со старением.

Это, очевидно, хорошенький ушат холодной воды на головы тех обладателей денежных средств, которые иначе могли бы заинтересоваться вложением денег в разработки, касающиеся связанных с возрастом мутаций митохондриальной ДНК.

Поскольку желательно, чтобы как можно быстрее появился клинически приемлемый метод борьбы со старением, аллотопическая экспрессия имеет то преимущество, что она уже разрабатывается в качестве метода лечения признанной группы заболеваний - митохондриопатий.

Так называют заболевания, обусловленные наследственными (или, реже, приобретенными по причинам, не связанным со старением) дефектами митохондриальной ДНК. Эти мутации ведут к упадку энергопроизводства, вследствие которого нарушаются функции различных органов в зависимости от конкретного дефекта: наиболее страдают мозг, сердце и мышцы, бывают поражены также печень, почки, легкие и некоторые железы. Поскольку аллотопическая экспрессия обещает лечение митохондриопатий, на ее разработку выделяется правительственное финансирование (правда, недостаточное); когда этот метод дойдет до клинического уровня, это побудит вкладывать средства в его развитие, что откроет дорогу для проверки в одобренных FDA клинических испытаниях.

А уж когда будет доказано, что аллотопическая экспрессия безопасна и эффективна для лечения наследственных мутаций митохондриальной ДНК, будет легко приспособить ее для мутаций, приобретенных в ходе старения. Такая параллельная применимость отличает большинство направленных против старения вмешательств, включенных в концепцию SENS; и, действительно, прототипные варианты ряда предложенных вмешательств сейчас уже проходят стадию клинических испытаний.
По стопам эволюции
Другие препятствия на пути аллотопической экспрессии имеют более научный характер. К счастью, как мы увидим, в последнее десятилетие эта область быстро и успешно развивалась. И еще лучше: эволюция на протяжении тысячелетий действовала в том же направлении.

В неизмеримо далеком прошлом одноклеточные организмы, к которым восходит наша родословная, вступили в симбиоз (взаимовыгодное совместное существование) с предками нынешних митохондрий, которые были не органеллами, а самостоятельными организмами. Будучи независимыми живыми существами, эти протомитохондрии имели полный набор собственной ДНК - не менее тысячи генов.

Но именно потому, что в полном опасностей окружении митохондрии для находящихся в них генов высок риск мутаций, в ходе эволюции выработалась аллотопическая экспрессия митохондриальных генов задолго до того, как появился человек. В неторопливом, как наступление ледника, эволюционном процессе копии генов, кодирующих митохондриальные белки, переносились в клеточное ядро, после чего исходные митохондриальные гены становились лишним компонентом и мутировали до бесконечности.

Надо отдать должное матери-природе: эволюция зашла по этому пути очень далеко. Из более чем тысячи генов изначально кодировавших митохондриальные белки, все, за исключением лишь тринадцати, перекочевали в ядро.

Начиная с середины 1980-х годов ученые при помощи биотехнологических методов преуспели в аллотопической экспрессии некоторых закодированных в митохондриальной ДНК белков. Правда, поначалу это удалось только у дрожжей, но теория получила практическое доказательство.
Эволюционные и прочие помехи
Но когда мы доходим до тринадцати кодирующих митохондриальные белки генов, находящихся в митохондриях человеческих клеток, дело оказывается куда хитрее. Почему эволюционный процесс остановился на этой точке, неясно, тут есть разные предположения, но, по общему мнению, существуют какие-то удерживающие факторы. Каковы бы они ни были, задача не обещает быть легкой. Нужно выяснить, что за факторы удерживают тринадцать генов в митохондриях, и придумать, как их преодолеть.

Один фактор, действующий не у всех живых организмов, но у человека имеющий значение, состоит в том, что код митохондриальной ДНК несколько отличается от ядерного (как бы разные диалекты одного языка), и из-за этого точная копия митохондриальной ДНК окажется "нечитабельной" в ядре. Эту проблему называют несоответствием кодов.

Ситуация здесь напоминает изменения в манере написания буквы "s" в английских текстах. До XIX в. "s" в середине слова писали с длинной "шеей", так что она походила больше на современную букву "f". Постепенно, по мере того, как умеющих писать становилось все больше, рукописное начертание букв более-менее унифицировалось, и "s" стали писать с более короткой "шеей", ближе к нынешнему сильно изогнутому варианту. И современный читатель документов эпохи Просвещения может перепутать морскую команду "Sail for the enemy" ("В атаку!") с противоположной - "Fail for the enemy!" ("Сдаемся!"), а то и вообще получится бессмыслица.

Из-за разницы в генетических кодах митохондриальной и ядерной ДНК перенос в ядро митохондриальных генов, содержащих "нечитаемые" последовательности, становится неподвластным эволюционному процессу. И, действительно, во всех генах, находящихся в настоящее время в митохондриях, имеются такие оригинальные участки; уже одним этим фактом можно объяснить, почему они не перешли в ядро. Но несоответствие кодов не составляет серьезной проблемы для биотехнологии: зная, в чем коды отличаются друг от друга, можно создать новый аллотопический ген согласно "ядерному" коду (как бы заменить одни значки другими), чтобы он нормально транслировался (т.е. синтезировался соответствующий белок), как это происходит с митохондриальными генами, перенесенными в ядро природой.

Другой фактор, по-видимому, представляет менее трудное препятствие для эволюционного переноса митохондриальных генов в ядро, но создает более сложную биотехнологическую задачу.
Речь идет о гидрофобности (от греческого hydor - "вода, влага" и phobos - "страх"; по сути: это отталкивание от молекул воды) многих из митохондриальных белков, гены которых находятся в митохондриях. В этих белках есть участки, которые в силу своей химической структуры столь сильно избегают контакта с водой, что молекула белка принимает такую форму, чтобы они оказались внутри нее.

Гирофобность не создает проблемы для белков, которые синтезируются по ДНК, находящимся в митохондриях, так как конечная пространственная структура (форма) такого белка запрограммирована, и его полипептидная цепь должна свернуться определенным образом, причем этому помогают специальные ферменты. Но если такой белок будет образовываться по ДНК, находящимся в ядре, то возникает препятствие: трансляция ядерных генов осуществляется в основном компартменте клетки - в цитоплазме, синтезированный белок оказывается в водной среде вне митохондрии, а его нужно как-то перенести внутрь нее через наружную и внутреннюю митохондриальные мембраны и поместить в точку его окончательной локализации.

Белки, разумеется, не могут свободно проходить через мембраны, иначе целостность митохондрии, а стало быть, и ее способность служить резервуаром протонов будет нивелирована постоянным "протеканием" внутрь и наружу. Однако же, есть нужда в трансмембранном переносе многих белков, например тех субъединиц комплексов электронтранспортной цепи, гены которых уже попали эволюционным путем в защищенное пространство ядра. Значит, у митохондрий выработался специальный механизм транслокации (переноса) белков через митохондриальные мембраны. Этот механизм называют комплексом TIM/TOM (TIM - транслоказа внутренней митохондриальной мембраны, TOM - наружной).

Но если белок в водном окружении в силу своей гидрофобности принял свернутую конформацию, то он уже не сможет пройти через комплекс TIM/ TOM, как невозможно протащить скрученную в ком вешалку для одежды через водосточную трубу. Хуже того - он его закупорит, т.е. не только новообразованные белки, кодируемые аллотопически экспрессирующимися генами, не попадут, куда им надо, но и многие другие белки, в норме поступающие в митохондрии с помощью комплекса TIM/TOM, окажутся "за бортом".

Все тринадцать белков, кодируемых митохондриальной ДНК, очень гидрофобны. Гены некоторых из них никогда не попадали в ядро ни у одного из видов живых организмов, и это гены наиболее гидрофобных белков -значит, гидрофобность действительно создает значительное препятствие на пути аллотопической экспрессии. Есть несколько вроде бы исключений, но я опубликовал подробный их разбор, объясняющий, почему эти кажущиеся противоречащими сказанному факты на самом деле таковыми не являются, почему они возникли в ходе эволюции, несмотря на проблему гидрофобности.

Итак, чтобы обойти проблему мутаций митохондриальной ДНК путем аллотопической экспрессии (что, по-моему, предпочтительно), нужно помимо "редактирования" последовательностей митохондриальной ДНК соответственно "ядерному диалекту" (что относительно несложно) найти способ переноса вновь синтезированных белков в митохондрии.
Использование изобретательности матушки-природы
Чтобы подступиться к проблеме гидрофобности, начнем с того, что посмотрим, нет ли в природе таких случаев (у других видов), когда эволюция уже проделала нужную нам черную работу. У человека и его эволюционных предков не было шанса на благоприятное сочетание "правильных" случайных мутаций, подходящей окружающей среды и нужного давления отбора, которые обусловили бы передачу ядерных вариантов соответствующих генов потомкам. Но такое счастливое стечение обстоятельств могло быть в эволюционной истории какого-либо другого вида.

Проблема гидрофобности решалась под действием естественного отбора независимо у многих видов и в ряде случаев была решена, а мы этих решений не унаследовали просто потому, что они были достигнуты в других ветвях эволюционного древа. Но, рассматривая относящееся к митохондриальной ДНК эволюционное наследие других видов, мы, может статься, найдем жизненные решения, которые остается лишь приспособить применительно к человеческим клеткам. Кодируемые митохондриальной ДНК белки у других видов отличаются от человеческих, но по структуре они достаточно близки к ним.

Резонно полагать, что, если бы их ввести в митохондрии клеток человека, они могли бы заменить природные или, по крайней мере, стало бы ясно, как нужно модифицировать аминокислотные последовательности человеческих белков, чтобы сделать их более транспортабельными. Если бы нашлись виды, у которых гены каких-то из тринадцати митохондриальных белков спонтанно перенеслись в ядро, можно было бы рассчитывать, что удастся ввести эти гены (с минимальными модификациями) в ядро человеческих клеток. Кодируемые ими белки синтезировались бы в цитоплазме и переносились в митохондрии, занимая место природных аналогичных белков в тех случаях, когда из-за мутаций последние не синтезируются в митохондриях.

Эта идея вовсе не плод фантазий - она уже осуществлена в изолированных человеческих клетках. Такая работа была начата в 1998 г., вскоре после важности открытия, сделанного восемью годами ранее, когда была определена нуклеотидная последовательность библиотеки митохондриальной ДНК зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii. Когда у этого организма были идентифицированы белки, кодируемые митохондриальными генами, путем их сравнения с соответствующими белками у других видов, оказалось, что у Chlamydomonas reinhardtii отсутствует шесть из тринадцати имеющихся у человека генов, кодирующих гидрофобные белки цепи переноса электронов.

Такие гены можно сравнить с загадочно исчезнувшими ключами от машины: они не потеряны - просто их нет там, где, как вы думаете, их оставили. У Chlamydomonas reinhardtii произошли изменения, требующиеся для того, чтобы обсуждаемые белки стали менее гидрофобными, потому что основное препятствие к этим изменениям - несоответствие кодов - не возникало.

Chlamydomonas reinhardtii столь близки к корням эволюционного древа, что у них нет несоответствия между ядерной и митохондриальной системами кодирования в ДНК. В отсутствие этого препятствия эволюции пришлось лишь обратиться к гораздо менее сложной проблеме гидрофобности митохондриальных белков. И здесь был достигнут некоторый успех. У нынешних Chlamydomonas reinhardtii гены, кодирующие эти белки, располагаются в клеточном ядре. Цитоплазматический механизм транслирует ядерную генетическую информацию, синтезируя белки, которые переносятся в митохондрии; так происходит с большинством митохондриальных белков у человека.

И здесь на сцену выходит Майк Кинг из Университета им. Томаса Джефферсона в Филадельфии. Поначалу Кинг интересовался не старением, а наследственными заболеваниями, обусловленными патологией митохондрий - митохондриопатиями. Ученые давно мечтали о генной терапии этих заболеваний, но делу мешали большие технические трудности введения генов непосредственно в митохондрии. Кинг рассчитывал, что аллотопическая экспрессия позволит быстрее добиться успеха.

Но проблема гидрофобности не снималась потенциальным решением, о котором говорили наследственные мутации генов тринадцати кодируемых митохондриальной ДНК белков, так же как и расчетом на мутирование митохондриальных генов в процессе старения из-за атаки свободными радикалами. Когда в конце 1990-х годов Майк Кинг узнал о существовании ядерных генов некоторых митохондриальных белков у зеленых водорослей, он сообразил, что произошедшее у водорослей можно было бы повторить применительно к людям с митохондриопатиями.

Дальнейшие события - пример поразительного прогресса. В 1998 г. Кинг вступил в плодотворное сотрудничество с Диего Гонзалес-Холфеном с кафедры молекулярной генетики Независимого национального университета в Мехико с целью идентифицировать и клонировать гены Chlamydomonas reinhardtii, кодирующие шесть аналогичных белков. За три года им удалось определить три из них.

Один такой ген, кодирующий белок АТР6 (компонент митохондриального комплекса V - "турбины"), представлял особый интерес, потому что его наследственные дефекты, вызванные мутациями, обусловливали два редких очень тяжелых расстройства мозговой и кишечной деятельности у человека, а именно коплекс симптомов, известный под сокращением NARP (от англ. Neuropathy, Ataxia, Retinitis Pigmentosa - нейропатия, атаксия, пигментный ретинит), и наследуемую по женской линии подострую некротизирующую энцефаломиопатию. При этих заболеваниях синтез АТР сокращается на 50-70%, что ведет к тяжелой дисфункции нервной и мышечной систем. Идентификация важных вариантов мутантных белков несла потенциальную возможность лечения людям, страдающим от этих серьезных расстройств, а также сулила всем остальным успех в борьбе со старением.

Эстафету подхватили Эрик Шон с сотрудниками с кафедры неврологии Колумбийского университета: они ввели клонированные копии гена, кодирующего водорослевый ген АТР6 в ядро человеческих клеток, митохондриальная ДНК которых несла мутации, обусловливающие эти тяжелые нервно-мышечные расстройства. И в клетках происходили трансляция введенных генов, синтез соответствующего белка в цитоплазме, перенос его в митохондрии, отщепление направляющей аминокислотной последовательности (последняя присоединяется к белку, чтобы направлять его в митохондрии) и включение белка в цепь переноса электронов, где он занимал место мутантного белка, спасая клетку от разрушительных эффектов мутации.

Иными словами, эти исследователи нашли у другого вида (у водорослей) в клеточном ядре кодирующий митохондриальный белок ген, аналог которого у человека находится в самих митохондриях, ввели его в ядерную ДНК человеческих клеток и показали, что в них он используется так же, как в клетках водорослей, восстанавливая почти до нормального функционирование клеток, несущих мутации, обусловливающие их дисфункцию.

Конечно, впереди еще много работы. Чтобы довести эту работу до уровня лечебного метода для людей с наследственными или связанными с возрастом мутационными дефектами митохондрий, нужны еще два достижения. Во-первых, требуется найти у других организмов или создать путем генетической инженерии гены для переноса в ядро, кодирующие остальные митохондриальные белки из числа кодируемых митохондриальной ДНК, и доказать, что они восстанавливают функционирование клеток с мутациями в митохондриальной ДНК.

Во-вторых, необходимо осуществить успешный перенос и продемонстрировать функциональный результат в целом организме, несущем такие мутации, - сначала на лабораторных животных, например на мышах, генетическое манипулирование которыми относительно хорошо разработано, а затем и на взрослых людях (здесь технология еще не разработана, но исследования в этом направлении идут столь интенсивно, что вполне можно ожидать появления безопасного и практичного терапевтического метода в обозримом будущем).

Ди Грей Обри

medbe.ru